小鼠股骨去骨髓模型的建立及活性维生素D缺乏对其骨修复影响的实验研究

【摘要】第一部分小鼠股骨去骨髓模型的建立和评价目的：建立小鼠股骨去骨髓模型，全面观察其膜内成骨愈合过程，为研究不同因素对骨折愈合影响提供可靠的动物模型。方法：将40只6周龄BABL/C小鼠的右侧股骨髁间开孔，细针破坏骨髓腔，真空抽出骨髓。运用血清检测、影像分析、组织染色、组织计量及分子生物学等方法研究小鼠股骨去骨髓后骨愈合过程中骨代谢相关血清离子浓度、骨痂形成及成骨、破骨细胞活动的改变。结果：去骨髓术后第2周，血清钙、磷离子浓度上升，第3周后下降至之前水平，而血清中PTH浓度变化趋势则相反；X线、微CT二维重建及骨痂组织切片总胶原染色显示，术后第1周骨髓腔内可见大量新生骨痂形成，第2周骨痂部分被吸收，第3周大部分已被吸收，残留骨痂发生钙化；骨痂组织切片HE染色显示成骨细胞占骨痂面积比在术后第1周水平较高，第2周达高峰后下降，ALP染色显示代表成骨细胞活性的ALP阳性面积术后第1周达高峰后下降，TRAP染色显示破骨细胞占骨痂面积比术后第2周显著上升并达高峰后，第3周下降；RT-PCR和Westernblot方法检测骨痂组织基因和蛋白表达同样显示：成骨相关的基因和蛋白表达在第1周达高峰，第2、3周逐渐下降，代表破骨活性的RANKL/OPG基因表达比值在第1周最大后降低。结果表明小鼠股骨去骨髓后成骨高峰发生在术后第1周，随着破骨细胞主导的骨重建进行，第3周完成髓腔重建，这些结果重现了去骨髓后膜内成骨修复的过程。结论：小鼠股骨去骨髓模型易于操作，可靠稳定；骨形成周期短，术后3周完成骨重建，可快速研究骨愈合机制；便于利用包括血清学、影像学、组织学和分子生物学多种方法全面观察骨修复过程。本实验利用小鼠去骨髓模型模拟了稳定性骨折膜内成骨愈合过程，为今后研究不同机制对膜内成骨修复的影响提供了重要的实验基础。第二部分活性维生素D缺乏对小鼠股骨去骨髓骨修复影响的实验研究目的：明确活性维生素D缺乏对小鼠股骨去骨髓（bonemarrowablation,BMX）后骨修复的影响。方法：选用6周龄野生型和1α(OH)ase基因敲除（1α(OH)ase-/-）小鼠作为实验对象，去股骨骨髓制作骨损伤模型。基因敲除组（KO）作为实验组，野生组（WT）作为对照组。通过血清检测的方法观察两组小鼠术前及术后第1、2、3周骨代谢相关的血清Ca、P、PTH浓度变化；通过影像学、组织化学的方法观察两组小鼠术后1、2、3周骨痂生成、吸收的变化；通过组织学、免疫组织化学和组织计量的方法观察两组小鼠术后1、2、3周骨痂中成骨细胞、破骨细胞活动的变化；进一步提取两组小鼠骨痂组织RNA和蛋白，通过分子生物学的方法观察活性维生素D缺失对骨形成及骨吸收相关基因和蛋白表达水平的影响。结果：KO组小鼠由于活性维生素D缺乏，继发低钙、低磷及高PTH血症，并且在制作去骨髓模型及随后骨修复过程中未改变，两组小鼠术后第2周都出现血清钙磷浓度升高，血清PTH浓度降低，第3周恢复到术前的水平。X线摄影、微CT三维重建和总胶原染色均显示：WT组小鼠第1周髓腔内见大量新生骨痂形成，随后第2周骨痂部分吸收，第3周大部分被吸收；KO组小鼠第1周髓腔内见大量新生骨痂形成，第2周骨痂继续形成并达高峰，第3周髓腔内这些骨痂大部分仍存留并矿化；同时发现，与WT组小鼠相比，KO组小鼠术后皮质骨变薄，骨痂矿化减少。通过组织学染色、免疫组化、组织计量及分子生物学方法研究发现：KO组小鼠术后1、2、3周髓腔骨痂成骨细胞数，ALP、I胶原染色阳性面积以及骨痂中ALP、I型胶原、Runx2、骨钙素（OCN）基因和Runx2、PTHR、胰岛素样生长因子I（IGF-I）蛋白表达均高于同观察点WT组；TRAP染色破骨细胞面积、RANKL/OPG基因比值低于相同观察点的WT组，而髓腔骨痂破骨细胞数在术后第2、3周明显高于WT组。对两组小鼠皮质骨切片进行ALP、TRAP染色发现：KO组小鼠术后第1、2、3周皮质骨ALP染色阳性面积比例及TRAP染色破骨细胞面积比例均显著高于同观测点WT组。结论：活性维生素D缺乏引起小鼠高PTH血症，在小鼠股骨去骨髓后骨修复过程中，髓腔小梁骨和皮质骨修复表现不一致。高PTH促进髓腔小梁骨骨形成，同时由于活性维生素D缺乏，致髓腔新生骨骨吸收减少，因而降低了骨转换；皮质骨骨形成和骨吸收都增加，骨转换提高。
【作者】王利；
【导师】严军；
【作者基本信息】苏州大学，骨外科学（专业学位），2014，硕士
【关键词】小鼠；去骨髓模型；稳定性骨折；膜内成骨；活性维生素D；高PTH血症；骨修复；

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